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產品描述

        HRbio™ miRNA qPCR Kit采用 SYBR Green I嵌合熒光法的原理進行miRNA的熒光定量檢測。本產品包含miRNA qPCR所需要的所有試劑，組分分別是：2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer。其中2×miRNA qPCR Mix（含SYBR Green）是專門為miRNA熒光定量檢測而特別研發的新一代預混液形式的qPCR試劑。其中DNA polymerase采用的是抗體修飾的熱啟動形式，配合特殊的buffer體系，使得反應特異性更好，靈敏度更高，并且在更廣的范圍內進行準確定量。

qPCR系列 蛋白與免疫熒光定量PCR試劑盒 產品組分

運輸與保存方法

1.-20°C 避光保存至少 12 個月，使用前充分融解混勻。

2.2 ×miRNA qPCR Mix(With Sybr Green)短期使用可放在 4°C，避免反復凍融。

3.Reverse primer(10μM )每次用完置-20°C 保存。

注意事項

1.miRNA 第一鏈cDNA 的加入量不要超過real time PCR 體積1/10。

2.對于特殊的檢測體系中，高含量的cDNA 模板易導致非特異性擴增，根據所檢測miRNA 的豐度適當的稀釋cDNA（5-10倍或者100倍）。

3.本品中含有熒光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反應液時應避免強光照射。

4.2 x miRNA qPCR Mix不含參比染料ROX，客戶并根據qPCR儀器技術指導決定是否需要加ROX參比染料，用于消除信號本底以及校正孔與孔之間產生的熒光信號誤差

5.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

6.本產品僅作科研用途！

操作步驟

1. 在室溫融化2 ×miRNA qPCR Mix和Reverse primer（10μM）。

2. 使用時請將2 ×miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經輕微離心后使用。如果試劑沒有混勻，其反應性能會有所下降。注：請不要使用振蕩器混勻。

3. 按照下表組分冰上進行反應液的配制：

【注】： 使用前務必充分混勻， 避免劇烈震蕩產生過多氣泡。

a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1- 1.0 μM之間進行調整。

b) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。

c) 模板稀釋：cDNA原液建議5- 10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環為好。

d) 反應體系：推薦使用20μL或50 μL ，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。

e) 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。

 qPCR系列 蛋白與免疫熒光定量PCR試劑盒

PCR 循環（三步法）

PCR 循環（二步法）

【注】高特異性可選擇兩步法，高效率擴增可選擇三步法。

a)  預變性時間： 根據不同模板和引物的具體情況可適當縮短至 2 min。

b)  退火溫度和時間：請根據引物和目的基因的長度進行調整。

c)  熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下：

30sec 以上： Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec 以上：Applied Biosystems: 7300

34sec 以上： Applied Biosystems: 7500

d)  熔解曲線： 通常情況下可以使用儀器默認程序。