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　　細胞培養(yǎng)過程中常見問題及解決方案

　　細胞培養(yǎng)是生命科學實驗中的基礎實驗，在細胞生長過程中，很多因素都會造成細胞生長不良。下面BUNSEN本生簡單歸納一下細胞生長不良的原因及對應的解決方案。

　　常見問題一：為什么細胞解凍后缺少活力，活細胞占比較低?

　　這種現(xiàn)象可能主要由以下幾種原因所導致：

　　1.培養(yǎng)物凍存液等質量欠缺。

　　解決方案：

　　a.確保用來制備儲存物(凍存液)的起始培養(yǎng)物需要保證其健康、無微生物污染、處于生長對數(shù)期后期狀態(tài)。

　　b.收獲細胞時需要小心翼翼，避免細胞損傷。

　　2.儲存物凍存方法不當

　　解決方案：

　　a.在液氮冷凍細胞時，確保細胞、培養(yǎng)基和其他試劑的濃度，以及凍存實驗步驟依照供應商的建議。一般來說，凍存應該緩慢，大約1-3° C/min以減少冰晶形成。

　　b.使用電子可編程或機械冷凍裝置以確保一致的、適當速率的冷凍。

　　c.選擇最合適的細胞冷凍保護劑。如果使用甘油，不要將其存儲在光照下，因為曝光會使甘油轉化為有對細胞毒性的。

　　3.儲存物保存不當

　　解決方案：

　　a.儲存物應時刻保持在-130℃，理想情況是置于液氮中，以確保較大的細胞活性。

　　b.如果將細胞直接浸入液氮中，容易造成液氮泄露到凍存管內，解凍時會有凍存管爆炸的風險。所以一般儲存在液氮上方的氣相環(huán)境中。

　　4.細胞解凍方法不當

　　解決方案：

　　a.一般來說，細胞應該快速解凍、使用預熱的培養(yǎng)基、盡快移除含有冷凍保護劑的培養(yǎng)基防止細胞活力下降。

　　b.確保小心操作細胞。不要渦旋或高速離心，因為低溫保存后的特別容易受到損傷。

　　常見問題二：細胞進行解凍或傳代后細胞的附著力偏低?

　　這種情況主要是因為濕度過低致使培養(yǎng)容器上集聚靜電所致。

　　可以通過適當增加房間濕度，使用防靜電裝置或者用消毒過的濕毛巾擦拭培養(yǎng)容器外側，來減低靜電產生。另外試劑混合不均勻，培養(yǎng)瓶轉速等因素也可導致此現(xiàn)象發(fā)生。所以在進行細胞培養(yǎng)時，要確保細胞和所有試劑的溶液混合充分。在使用振蕩培養(yǎng)箱進行細胞培養(yǎng)時，注意設置適宜的轉速。

　　常見問題三：為什么細胞生長速度緩慢?

　　細胞生長過慢有很多原因，其主要原因如下：

　　1.細胞的傳代次數(shù)太多，所以獲得一個新的、亞培養(yǎng)次數(shù)較少的細胞儲存液很有必要。

　　2.未選擇合適的細胞收獲時機。

　　在使用新的細胞儲存液的同時，也要把我好適宜的細胞收獲時機，一般在對數(shù)生長期的后期是細胞收獲時間當細胞達到*融合后，由于生長過于擁擠，會逐漸進入緩慢生長階段，此時，細胞的活躍度也會隨之下降。

　　培養(yǎng)基、血清、緩沖液等質量差，或者配方不合理。培養(yǎng)基、血清等培養(yǎng)物質是細胞生長的主要營養(yǎng)來源，所以其質量直接會影響到細胞的生長狀態(tài)。所以高質量的培養(yǎng)基及合理的試劑配方維持細胞的良好生長具有決定的作用。

　　3.CO2濃度與緩沖系統(tǒng)需求不匹配，導致pH控制不足。

　　一般來說，細胞培養(yǎng)液中緩沖液中NaHCO3的濃度與CO2濃度成正比例關系。緩沖液中NaHCO3 的濃度高，所需求的CO2濃度也較高;這樣才能達到PH平衡。

　　4.微生物污染，尤其是支原體

　　及時檢查污染，防止微生物污染，做好支原體、器皿、環(huán)境消毒、支原體清除等工作。

　　5.培養(yǎng)物光敏降解產生細胞毒性物質。

　　如果培養(yǎng)基長時間暴露于熒光將會導致光敏感培養(yǎng)基組分轉化成細胞毒性自由基和H2O2，從而影響到細胞生長甚至細胞凋亡。所以平時要在暗處保存細胞核培養(yǎng)基，避免熒光暴露。

　　6.不精確的細胞計數(shù)方法將導致細胞生長不良

　　a.確保計數(shù)樣本充分混合，避免局部細胞密度差異影響精確計數(shù)

　　b.再次檢查使用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)的所有運算

　　常見問題四：為什么細胞生長會不均勻?

　　1.細胞或培養(yǎng)基的混合不充分：在培養(yǎng)基中接入細胞后應當輕搖混勻，在進入振蕩培養(yǎng)箱后，保證持續(xù)穩(wěn)定的振幅頻率，避免局部濃度差異。

　　2.在細胞培養(yǎng)過程中有時候會出現(xiàn)同一時期相同器皿之間細胞生長不平衡。

　　這種情況可能是由于培養(yǎng)箱內部的溫度不均一所導致。注意做好以下兩點：

　　a.避免將培養(yǎng)器皿疊放，因為底部的培養(yǎng)器皿最靠近金屬架可能加熱最快。

　　b.如果放在培養(yǎng)箱前部的培養(yǎng)器皿比后面的生長慢，要注意保持培養(yǎng)箱的門盡可能關嚴，并將前面的培養(yǎng)器皿移到后面。