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實時熒光定量PCR(realtime PCR)
更新時間:2019-09-17瀏覽:2691次

  實驗方法原理:

  實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

  儀器、耗材:

  離心管

  離心機

  風光光度計

  電泳槽

  凝膠板

  Realtime PCR儀

  實驗步驟:

  一、 樣品RNA的抽提

  1. 取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。

  二、 RNA質量檢測

  1. 紫外吸收法測定

  先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。

  (1)濃度測定

  A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為:A260 x 稀釋倍數 x 40 ug/ml。具體計算如下:

  RNA溶于40 ul DEPC水中,取5 ul,1:100稀釋至495 ul的TE中,測得A260 = 0.21

  RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

  取5 ul用來測量以后,剩余樣品RNA為35 ul,剩余RNA總量為:

  35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

  (2)純度檢測

  RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。

  2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測定

  (1)制膠

  三、樣品cDNA合成

  四、 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因(β-actin)實時定量PCR

  五、 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板

  六、 待測樣品的待測基因實時定量PCR

  1. 所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。

  2. 體系配置如下:

  序號 反應物 劑量

  1 SYBR Green 1 染料 10 ul

  2 上游引物 1 ul

  3 下游引物 1 ul

  4 dNTP 1 ul

  5 Taq聚合酶 2 ul

  6 待測樣品cDNA 5 ul

  7 ddH2O 30 ul

  8 總體積 50 ul

  輕彈管底將溶液混合,6 000 rpm短暫離心。

  (3)將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為:93℃ 2分鐘預變性,然后按93℃ 1分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘,共40做個循環,后72℃7分鐘延伸。

  七、 實時定量PCR使用引物列表

  引物設計軟件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構;引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。

  八、電泳

       各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView染色,檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

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